早期肌肉特异性mRNA在骨髓干细胞的表达论文

           作者：曾缨，张成，李才明，柳太云

【关键词】  骨髓祖代细胞；组织特异性；肌形成调节因子

　　Expression of early muscle specific mRNA in bone marrow stem cells

　　【Abstract】  AIM:  To study the expression of early  muscle specific mRNA in  bone marrow stem cells.  METHODS:  The expression of early muscle specific mRNA, including MyoD, Myf5, myogenin, MRF4 and desmin, in bone marrow stem cells of C57 mice of different phases and SD rats of different generations was detected by reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR).  RESULTS:  In different cultured phases (day 0,2,7) of C57 mouse bone marrow stem cells, RTPCR analysis showed the presence of Myf5 and desmin, whereas MyoD, myogenin and MRF4 were not detected. In different generations (from the primary to the 6th generation) of rat bone marrow mesenchymal stem cells, MyoD and desmin were detected, whereas myogenin and MRF4 were not detected by RTPCR analysis.  CONCLUSION:  Bone marrow stem cells can express early muscle specific mRNA to some extent.

　　【Keywords】 myeloid progenitor cells;  tissuespecificity;  myogenic regulatory factors

　　【摘要】 目的： 研究早期肌肉特异性mRNA在骨髓干细胞中的特异性表达.  方法： 利用RTPCR研究不同时期C57鼠和不同代龄SD大鼠骨髓干细胞早期肌肉特异性mRNA（包括MyoD, Myf5, myogenin, MRF4和desmin）的表达.  结果： Myf5及desmin在新鲜分离、培养了2 d和7 d的悬浮与贴壁的C57小鼠骨髓干细胞中均有表达，没有检测到MyoD, myogenin和MRF4在此时期小鼠骨髓干细胞的表达. MyoD与desmin在原代至第6代SD大鼠骨髓间质干细胞中均有表达，没有检测到myogenin和MRF4在各代细胞中的表达.  结论： 骨髓干细胞能表达一定水平的早期肌肉特异性mRNA.

　　【关键词】 骨髓祖代细胞；组织特异性；肌形成调节因子

　　0引言

　　在不同的诱导条件下，成体造血干细胞可分化形成脑的星形胶质细胞，少突胶质细胞，小胶质细胞，肌细胞和肝细胞等，骨髓间质干细胞在体内外也可分化为肝、软骨、脂肪、骨、肾、肌腱、脑和肌细胞等［1-2］. 目前对骨髓干细胞可塑性的研究很多，而且对骨髓干细胞表达抗原的研究普遍集中在对其表面抗原表达的研究方面，而对组织特异性抗原在未分化骨髓干细胞的表达的研究报道却较少［3］. 我们的研究旨在探讨肌肉特异性抗原desmin和成肌调节因子（myogenic regulatory factors，包括MyoD，Myf5，myogenin和MRF4）在骨髓干细胞的表达情况.

　　1材料和方法

　　1.1材料大鼠骨髓干细胞（rMSC）和小鼠骨髓干细胞(mMSC)分别取自SD鼠和C57BL/6J鼠的股骨与胫骨骨髓；正常SD鼠和C57BL/6J鼠购于中山大学中山医学院实验动物中心，体质量分别为100 g和20 g，雄性. DMEM， F10干粉培养基，胰蛋白酶粉剂，RTPCR试剂盒（ThermoscriptTMRT），Trizol（美国Gibco）；胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）(美国 Hyclone公司）；DEPC（美国Sigma公司）. 所选用或设计的RTPCR引物均至少跨越1个外显子，这就避免了因DNA污染而产生假阳性的可能性. 所有引物均由上海生工合成（表1）.
 
　　1.2方法

　　1.2.1rMSC的分离与原代培养乙醚麻醉SD鼠，置700 mL/L乙醇消毒1 min，超净工作台无菌条件下取出后肢股骨与胫骨，断开骨端，将骨髓细胞冲至盛有含100 mL/L FBS完全培养液的无菌小烧杯中，900 r/min离心10 min，用含100 mL/L FBS的培养液悬浮沉淀细胞，接种至培养瓶，放置50 mL/L CO2, 37℃,饱和湿度的CO2培养箱中静置原代培养.
 
　　1.2.2mMSC的分离与原代培养mMSC的培养基为含200 mL/L FBS的F10与LDMEM培养液，余同rMSC.

　　表1RTPCR引物（略）

　　1.2.3rMSC的传代待上述rMSC贴壁细胞接近80%~90%融合时，用2.5 g/L胰酶37℃消化，加入含100 mL/L FBS的培养液终止消化，收集细胞，900 r/min离心10 min，用含100 mL/L FBS的培养液悬浮沉淀细胞，将细胞悬液以1∶2或1∶3分配比例接种传代， 2~3 d换液1次，倒置相差显微镜下逐日观察、记录并照相.
 
　　1.2.4MyoD, Myf5, myogenin, MRF4和desmin的RTPCR检测提取细胞总RNA，ThermoScriptTM逆转录，PCR扩增，反应体系为：10 mmol/L dNTP 1 μL, 10×buffer 5.0 μL, 引物（10 μmol/L）上游2.0 μL，下游2.0 μL，样品cDNA 2.0 μL，Tag酶1 μL（16.67 nkat），反应总体积50 μL；反应条件为： 94℃预变性2 min→94℃变性1 min→59~68℃退火1 min→72℃延伸1 min（30个循环）→最后72℃延伸10 min→4℃保存. 之后用20 g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后置凝胶自动成像仪拍照记录.
 
　　1.2.5mMSC表面标志物的检测收集培养了2 d的小鼠骨髓干细胞的悬浮部分，PBS洗涤3次，加入饱和浓度FITC荧光标记的大鼠抗小鼠CD34FITC抗体，室温下避光孵育30~45 min，PBS洗涤， FACScan流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达；再用破膜剂破膜，40 g/L多聚甲醛固定15 min，加入饱和浓度PE荧光标记的小鼠抗小鼠desmin抗体，室温下避光孵育30~45 min，PBS洗涤，FACScan流式细胞仪检测细胞质内desmin抗原的表达.