【关键词】  脂联素；肿瘤坏死因子α；内皮,血管/细胞学；动脉硬化

　　Influence of adiponectin on vascular inflammatory reaction mediated by TNFα

　　LIU JinBo, DENG HuaCong, GE Qian, LI BingRong, ZHENG HongTing, LAN LiZhen

　　Department of Endocrinology, First Affiliated Hospital, Chongqing Medical  University, Chongqing 400016, China

　　【Abstract】 AIM: To investigate the influence of adiponectin on the inflammatory reaction in vascular endothelial cells induced by TNFα. METHODS: Human umbilical vein endothelial cells(HUVEC) were cultured in vitro and divided into normal group, TNFα stimulation group and adiponectin and TNFα associated  stimulation group. HUVEC were preincubated with human recombinant adiponectin for 30 min to 16 h, then exposed to human recombinant TNFα for 6  to 12 h (adiponectin and TNFα associated  stimulation group), which was then  compared with TNFα stimulation group in the expressions of NO, iNOS, ET1 and MCP1.  The interaction between adiponectin and HUVEC was estimated by chemical method, radioimmunoassay and ELISA. RESULTS: The expressions of NO, iNOS, ET1 and MCP1 were increased in HUVEC stimulated by TNFα for 6  to 12 h (607.7±7.6, 42.2±2.2, 199.3±11.9, 167.7±15.9 vs 543.5±2.2, 23.8±2.0, 148.4±5.3, 128.0±8.4; P<0.05). Compared with TNFα stimulation group, the expressions of NO, iNOS, ET1 and MCP1 in adiponectin and TNFα associated  stimulation group were decreased (565.7±13.0, 36.5±2.7, 170.8±8.3, 142.6±5.6 vs 607.7±7.6, 42.2±2.2, 199.3±11.9, 167.7±15.9; P<0.05). CONCLUSION: Adiponectin can modulate endothelial inflammatory response through effecting the expressions of some inflammatory factors, and adiponectin has protective actions against  the initiation and progression of atherosclerosis.

　　【Keywords】 adiponectin; tumor necrosis factoralpha; endothelium, vascular/cytology;  arteriosclerosis

　　【摘要】 目的： 探讨脂联素对肿瘤坏死因子（TNFα）引起的血管内皮细胞炎症反应的影响. 方法： 体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）. 随机分为对照组，TNFα刺激组和脂联素+TNFα刺激组. HUVEC与脂联素联合孵育一段时间后再给予TNFα刺激与单纯TNFα刺激做对照，分别采用化学法，放免法及ELISA法检测脂联素对血管内皮细胞NO, iNOS, ET1及MCP1蛋白表达的影响. 结果： HUVEC经TNFα刺激6~12 h后其NO, iNOS, ET1及MCP1蛋白的表达（607.7±7.6, 42.2±2.2, 199.3±11.9, 167.7±15.9）与对照组（543.5±2.2, 23.8±2.0, 148.4±5.3, 128.0±8.4）相比明显增强（P<0.05）；当HUVEC在TNFα刺激之前首先与脂联素共同孵育一段时间后，则血管内皮细胞NO, iNOS, ET1及MCP1蛋白的表达（565.7±13.0, 36.5±2.7, 170.8±8.3, 142.6±5.6）与单纯给予TNFα刺激相比明显减弱（P<0.05）. 结论： 脂联素可以通过抑制血管内皮细胞某些炎症因子的表达水平来调节血管内皮细胞的炎症反应，从而发挥其抗炎，抗动脉粥样硬化的作用.
 
　　【关键词】 脂联素；肿瘤坏死因子α；内皮，血管/细胞学；动脉硬化

　　0引言

　　脂联素（adiponectin）作为一种仅由脂肪细胞分泌的脂肪细胞因子，因其具有改善胰岛素抵抗、抗炎及抗动脉粥样硬化活性而成为当前研究的热点. 体外研究证实，生理浓度范围内的脂联素通过抑制NFкB信号传导通路能够剂量依赖性的抑制肿瘤坏死因子（TNFα）介导的血管内皮细胞黏附分子的表达. 因此， 设想脂联素对于血管内皮细胞分泌的其他炎症因子有可能也具有相类似的作用. 我们通过观察脂联素对血管内皮细胞表达NO, iNOS, ET1及MCP1的影响来进一步明确其抗动脉粥样硬化机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料人脐静脉内皮细胞株（human umbilical vein endothelial cells, HUVEC）购自中科院细胞库；重组人脂联素购自美国R＆D公司；重组人肿瘤坏死因子购自北京宝赛生物技术有限公司；NO检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所；内皮素放免试剂盒购于北京东亚免疫研究所；人 MCP1 ELISA试剂盒购自美国BIOSOURCE公司；722光栅分光光度计，重庆川仪九厂；自动放免仪中国科大中佳公司；BioTEK ELX800型酶标仪.
 
　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养人脐静脉内皮细胞株培养于含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养液中，置于37℃, 50 mL/L的CO2培养箱中培养，每2～3 d用2.5 g/L胰酶消化传代. 生长至85%融合时接种于96孔细胞培养板，接种细胞密度为1×105个/mL，待细胞贴壁后，改用无血清RPMI 1640培养液继续培养24 h，弃去旧的培养液后用于下一步实验.
 
　　1.2.2脂联素对内皮细胞表达NO, iNOS, ET1的影响① 实验分组： 按照随机化分组的原则，每组重复5孔. 对照组；TNFα刺激组： 根据预实验结果确定TNFα终浓度10 μg/L; TNFα+脂联素刺激组： 根据预实验结果确定脂联素终浓度为10 mg/L; 10 mg/L脂联素作用0.5 h后加入10 μg/L TNFα. ② NO测定： 上述干预因素作用6 h后取细胞培养上清液检测，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行. ③ 分型NOS测定： NOS主要有结构型（cNOS）和诱导型（iNOS）两类，cNOS依赖钙，而iNOS不依赖钙，据此可分型. 上述干预因素作用6 h后取细胞培养上清液检测具体操作严格按说明书进行. ④ ET1测定： 上述干预因素作用12 h后取细胞培养上清液检测，采用放免法，I125标记抗原. 具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行.
 
　　1.2.3脂联素对内皮细胞表达MCP1的影响① 实验分组： 按照随机化分组的原则，每组重复4孔. 对照组；TNFα刺激组： 同上；TNFα+脂联素刺激组： 加入不同浓度的脂联素（12.5, 25, 50 mg/L），培养细胞16 h，再加入10 μg/L TNFα继续作用6 h；② MCP1测定： 取细胞培养上清液100 μL,双抗体夹心ABC ELISA法检测MCP1蛋白表达，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行.
 
　　统计学处理： 采用SPSS 13.0软件对资料进行分析，多组均数比较采用单因素方差分析（OneWay ANOVA）. 方差齐时，两两间比较采用LSD法，方差不齐时，两两比较采用Tamhanes T2法. P<0.05表示差异具有统计学意义. 所有结果均以x±s表示.

　　2结果

　　2.1脂联素对TNFα损伤状态下的内皮细胞NO, iNOS及ET1表达的影响TNFα组NO, 总NOS, iNOS及ET1表达水平明显高于对照组（P<0.01）, cNOS明显降低（P<0.01）;TNFα+脂联素刺激组NO, 总NOS, iNOS及ET1表达水平明显低于TNFα组（P<0.05），但与对照组相比仍明显增高（P<0.01）, cNOS明显升高（P<0.01），但未恢复到正常水平，说明脂联素可部分逆转TNFα对内皮细胞的损伤作用（表1）.