单纯疱疹病毒2型糖蛋白G的基因扩增、克隆及其B细胞抗原表位分析论文

            作者：王茜，曾抗，孙乐栋，周再高，刘凤岩

【关键词】  单纯疱疹病毒2型；包膜糖蛋白G

　　Gene cloning and B cell antigen epitope analysis of HSV2 glycoprotein G

　　【Abstract】 AIM: To clone fulllength glycoprotein G (gG2) gene of herpes simplex virus type Ⅱ(HSV2) and make a forecast to B cell antigen epitope of gG2. METHODS: The gG2 gene of HSV2 amplified by PCR was inserted into   pGEMT carrier, then transected into E.coli DH5α cells for sequencing. Then, B cell antigen epitope was analyzed  by Lasergene, Clustal X softwares. RESULTS: We have cloned fulllength gG2 gene of HSV2. By making an analysis to B cell epitope of gG2, we found that the homology in Nterminal of gG1 and gG2 genes of HSV was very low. B cell antigen epitope of gG2 of HSV2 showed a very high antigen index in "peculiarity domain". CONCLUSION: The successful cloning of fulllength gG2 of HSV2 and a successful forecast to B cell epitope of gG2 provide evidences and references for developing diagnostic kits for herpes virus infection and finding better target sites of HSV2 vaccine.

　　【Keywords】 herpes simplex virus type Ⅱ; glycoprotein G2; genes cloning; epitope

　　【摘要】 目的：克隆单纯疱疹病毒2型（HSV2）糖蛋白G2(gG2)全长基因并对糖蛋白G2进行B细胞抗原表位预测. 方法：用PCR法扩增HSV2的gG2基因，连接到pGEMT载体，转化大肠杆菌DH5α株后测序. 利用Lasergene，Clustal X等软件，进行B细胞抗原表位预测. 结果：完成单纯疱疹病毒2型（HSV2）gG2全长基因克隆. 通过B细胞抗原表位分析，发现HSV1的gG1和HSV2的gG2氨基端的同源性很低. gG2蛋白在“独特区”存在抗原指数非常强的抗原表位. 结论：成功构建单纯疱疹病毒2型（HSV2）gG2全长基因克隆，为单纯疱疹病毒感染的诊断试剂的研发及抗单纯疱疹病毒疫苗研究寻找更好的靶位点提供研究材料和参考.

　　【关键词】 单纯疱疹病毒2型；包膜糖蛋白G2；基因克隆；抗原表位

　　0引言

　　单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）是引起人类病毒性疾病中常见的病毒之一，可分为HSV1和HSV2两种血清型. HSV2型主要感染外生殖器和躯干下部皮肤，引起生殖器疱疹、新生儿疱疹. 目前认为与生殖器恶性肿瘤相关，并增加了AIDS的感染机会［1］. HSV2病毒颗粒中至少有11种包膜糖蛋白，其中gG2为型特异性抗原［2］，在单纯疱疹2型病毒诊断、分型和疫苗研究中起到重要作用. 我们对HSV2 的gG2基因进行克隆，并利用生物信息学软件对gG2基因进行B细胞抗原表位分析，为gG2蛋白作为诊断试剂和疫苗研究打下基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料HSV2病毒株由本课题组在广东地区单纯疱疹感染患者中分离培养并感染于Vero细胞中保存，Vero细胞、DH5α细胞由本实验室保存. DNAzsolE， DNA纯化试剂盒购自申能博彩公司，ExTaq酶、dNTP购自TaKaRa公司，pGEMT载体购自Promega公司.

　　1.2方法

　　1.2.1引物设计根据GenBank提供的HSV2病毒（Genbank access number: Z86009）基因组全序列，利用LasergenePrimerSelect软件设计引物. 上游的引物序列是5′AAGCTTACCTTGCCGCCCGGCGTCA3′；下游的引物序列是5′GCGGCCGCTTATCGTGGACATTTGGTCG3′. 引物由上海博亚生物技术有限公司合成.

　　1.2.2DNA提取采用DNAzsolE从HSV2病毒Vero细胞培养上清中提取DNA.

　　1.2.3gG2基因的扩增使用TaKaRa公司ExTaq酶进行PCR. 反应液包括：2.5 mmol的dNTPs 3 μL，10×PCR buffer 3 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ExTaq 0.5 μL，cDNA模板5 μL，H2O 16.5 μL，总体积30 μL. 反应条件：94℃，2 min；94℃，30 s，55℃，1 min，72℃，2 min，30个循环；72℃ 8 min，4℃保存.

　　1.2.4基因克隆使用申能博采公司DNA纯化试剂盒回收PCR产物，将回收产物与pGEMT载体连接， 4℃放置12 h. 将重组载体转化DH5α感受态细胞，于氨苄青霉素抗性固体LB培养基上37℃培养16 h，利用XGal和IPTG筛选阳性重组克隆. 获得的阳性克隆菌扩大培养，提取质粒分别经PCR和双酶切初步鉴定，送TaKaRa公司测序.  利用protean软件对HSV2病毒gG2基因以及HSV1病毒gG1基因进行B细胞抗原表位分析，并比较这两型单纯疱疹病毒糖蛋白G之间的异同.